Imagerie en accéléré de cellules du cortex cérébral primaire de souris transfectées

Résumé

Source : Landeira, B. S.,et al., Imagerie en direct des cellules primaires du cortex cérébral à l’aide d’un système de culture 2D. J. Vis. Exp. (2017)

La vidéo démontre l’utilisation de l’imagerie time-lapse pour suivre les progéniteurs corticaux marqués par fluorescence, surveiller leur division et leur différenciation, et étudier le développement de la lignée dans les cellules primaires du cortex cérébral

Protocole

1. Vidéomicroscopie time-lapse

REMARQUE : Cette étape nécessite un microscope à fluorescence inversée avec une chambre d’incubation (voir Tableau des matériaux).

1. Après l’infection par le rétrovirus, placez la plaque de culture tissulaire dans un incubateur connecté à des contrôleurs de température et de CO₂.
   REMARQUE : Préchauffer la chambre pendant 3 h avant de commencer l’imagerie pourrait aider à minimiser la dérive et la défocalisation pendant l’acquisition.
   REMARQUE : La chambre doit maintenir les cellules à des conditions constantes de 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Sélectionnez une position dans l’axe XY qui servira de point zéro (XY = 0). Cela permettra à une référence de retrouver les positions à l’avenir.
   NOTE : Il est conseillé de dessiner un signe sur la plaque qui peut être utilisé comme référence pour déterminer le point zéro.
3. Sélectionnez les positions à imager avec un grossissement de 10X.
   REMARQUE : Sélectionnez 10-15 positions par puits pour augmenter la probabilité d’observer des cellules transfectées rétroviralement.
   REMARQUE : Les objectifs longue distance à fort grossissement (20X ou 40X) peuvent être utilisés pour obtenir des images de plus haute résolution. En fonction de la distance de travail des objectifs, des plaques à fond de verre peuvent être nécessaires.
4. Acquérez des images en contraste de phase toutes les 5 minutes et des images de fluorescence toutes les 3 heures pour réduire la phototoxicité. Vérifiez et ajustez la mise au point dans les 3 premières heures de l’expérience, car elle peut changer pendant que la température s’équilibre. Vérifiez et ajustez la mise au point quotidiennement.
   NOTE : Nous observons que la mise au point devient stable après les premières 24 heures. Cependant, il est conseillé de surveiller la mise au point. Vous pouvez également utiliser un système de mise au point automatique basé sur un logiciel.
5. Après 7 jours, arrêtez l’acquisition.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurich
Microscope observateur cellulaire	Zeiss
The Tracking Tool (tTt) logiciel		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html